通過直接從冷凍瓶接種抗體生產(chǎn)生物反應(yīng)器來強化工藝

通過工藝強化，有幾種方法可以使抗體生產(chǎn)過程更高效、更便宜。在本研究中，使用超高細胞密度工作細胞庫將來自冷凍管的細胞直接接種到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中。在實驗室規(guī)模實驗之后，成功進行了補料分批中試規(guī)模實驗作為概念驗證。此外，細胞以 2L 規(guī)模在灌注模式下培養(yǎng)。這里介紹的強化方法可以消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器外的接種物生產(chǎn)，并通過節(jié)省時間和空間來創(chuàng)造額外的生產(chǎn)能力。與補料分批模式相比，在灌注模式下，生物反應(yīng)器生產(chǎn)率可提高 180% 以上。

關(guān)鍵詞：中國倉鼠卵巢細胞、補料分批、灌注、1:10 調(diào)節(jié)比、超高細胞密度冷凍管

1  介紹

盡管在最近的新冠疫情期間疫苗的批準(zhǔn)和生產(chǎn)激增，單克隆抗體 (mAb) 仍然是最重要的生物制藥，仍然占生物制藥銷售額和新批準(zhǔn)生物制藥的 50% 以上。這些抗體大多用中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞生產(chǎn)，主要用于治療炎癥和自身免疫性疾病以及癌癥 。

由于這對生物制藥制造商的重要性，近年來 mAb 生產(chǎn)工藝的改進一直是關(guān)注的焦點，目的是降低生產(chǎn)成本并實現(xiàn)更高的生物反應(yīng)器生產(chǎn)率和制造能力。該工藝強化應(yīng)用于上游和下游操作。在上游工藝中，強化的重點有三個領(lǐng)域：i. 細胞庫，ii. 接種物生產(chǎn)，以及 iii. 抗體生產(chǎn)工藝。建立高細胞密度或大容量細胞庫以改進細胞冷凍工藝的方法已被多個研究小組描述。

在這里，通過在冷凍管中冷凍高達 260 × 106 細胞 mL–1 的細胞密度 [11] 或在冷凍袋中冷凍高達 150 mL 的體積 ，可以實現(xiàn)每個冷凍單位的大量細胞，這反過來又可以使解凍后搖瓶中的細胞膨脹變得過時。

為了進一步強化種子培養(yǎng)，N-1 灌注是一種選擇。在這里，種子培養(yǎng)的最后一步是在灌注模式下進行的，目標(biāo)是活細胞密度 (VCD) 高達 200 ×106 細胞 mL–1，以便隨后接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器 [7, 12–15]。強化細胞庫和 N-1 灌注相結(jié)合用于一步接種物生產(chǎn)已經(jīng)成功實施 [6,10,15]。

例如，可以通過高接種量補料分批生產(chǎn)來實現(xiàn) mAb 生產(chǎn)工藝的強化，即在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中接種高起始 VCD，以縮短生產(chǎn)過程并實現(xiàn)更高的產(chǎn)量 。作為補料分批工藝的替代方案，近年來，連續(xù)生產(chǎn)工藝的趨勢已變得明顯。這些灌注工藝的優(yōu)勢在于，可以在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)以恒定的濃度和質(zhì)量收獲產(chǎn)品，從而簡化了下游流程。近年來，一次性領(lǐng)域的新發(fā)展使得連續(xù)生產(chǎn)工藝在上游和下游領(lǐng)域都變得更容易、更安全。借助現(xiàn)代細胞系、培養(yǎng)基和一次性設(shè)備，與補料分批工藝相比，灌注工藝可以實現(xiàn)更高的時空產(chǎn)量。即使在傳統(tǒng)上被稱為中試規(guī)模而非生產(chǎn)規(guī)模的生物反應(yīng)器中，可實現(xiàn)的生產(chǎn)率 > 1gL–1d–1，也使得能夠同時生產(chǎn)與以補料分批模式運行的立方米規(guī)模一次性生物反應(yīng)器相當(dāng)數(shù)量的抗體。此外，由于占地面積較小，可以同時運行多個較小的生產(chǎn)生物反應(yīng)器。例如，BiosanaPharma 擁有一種處于臨床 III 期的奧馬珠單抗生物仿制藥，該藥以 50L 生物反應(yīng)器規(guī)模生產(chǎn)，計劃成為第一個以連續(xù)生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的抗體 [30]。

在強化 mAb 生產(chǎn)工藝時，還應(yīng)考慮產(chǎn)品質(zhì)量。工藝變化會影響質(zhì)量參數(shù)。經(jīng)常分析的參數(shù)是糖基化模式、抗體電荷變體的比例以及碎片和聚集體的比例 [31–35]。其中一些參數(shù)是關(guān)鍵質(zhì)量屬性，即它們可能對生物活性、藥代動力學(xué)、免疫原性或安全性產(chǎn)生重大影響。在功能測定和臨床研究中，應(yīng)逐個抗體研究關(guān)鍵質(zhì)量屬性 。

在之前的研究中，描述了一個 > 250×106 細胞 mL–1 的細胞庫的建立 [11]。隨后，該細胞庫被用于在實驗室和中試規(guī)模中成功實現(xiàn)低種子和高種子補料分批工藝的一步接種物生產(chǎn) [15]。本研究旨在通過消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器之前的所有種子培養(yǎng)步驟來進一步強化上游工藝。為此，補料分批實驗以及灌注生物反應(yīng)器直接接種來自超高細胞密度工作細胞庫 (UHCD-WCB) 冷凍管的細胞（圖 1）。在中試規(guī)模中，使用 HyPerforma DynaDrive S.U.B. 生物反應(yīng)器 (Thermo Scientific) 的高調(diào)節(jié)比，在 50L 生物反應(yīng)器中僅接種 5L 工作體積。這種方法可以大大簡化生產(chǎn)過程，因為接種物生產(chǎn)不再需要基礎(chǔ)設(shè)施和生物反應(yīng)器，并且可以將手動操作減少到限度。

2 材料和方法

2.1 細胞系和培養(yǎng)基

在所有培養(yǎng)中，均使用產(chǎn)生免疫球蛋白 G (IgG) 的 ExpiCHO-S 細胞系 (Gibco)。對于補料分批培養(yǎng)，使用 Efficient-Pro 培養(yǎng)基 (Gibco) 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用 Efficient-Pro Feed 2 (Gibco) 作為補料溶液?；A(chǔ)培養(yǎng)基中添加了 6mmolL–1 L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich) 和 0.1% 抗凝劑 (Gibco)。灌注培養(yǎng)使用添加了 4mmolL–1 L-谷氨酰胺和 0.1% 抗凝劑的高強度灌注 CHO 培養(yǎng)基 (Gibco)。培養(yǎng)開始時使用 0.66x 濃縮培養(yǎng)基，灌注時使用 1x 濃縮培養(yǎng)基。

圖 1. 使用 UHCD-WCB 進行的實驗的示意圖。

2.2 接種物生產(chǎn)

根據(jù) Muller 等人描述的步驟，在搖瓶（Corning）中在 7 天內(nèi)進行標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)。在沒有種子培養(yǎng)的實驗中，將來自 UHCD-WCB 的冷凍保存細胞（VCD 為 260 ×106 細胞 mL–1）解凍，然后直接轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)系統(tǒng)中（50L 培養(yǎng)，使用裝有預(yù)熱培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移瓶）或在搖瓶中以 1:10 的比例稀釋，并加入預(yù)熱培養(yǎng)基（搖瓶和實驗室規(guī)模的生物反應(yīng)器）。測定 VCD 后，將必要量的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的培養(yǎng)系統(tǒng)中。

2.3補料分批模式下的 IgG 生產(chǎn)

在三種不同的培養(yǎng)系統(tǒng)中進行了補料分批模式的 IgG 生產(chǎn)實驗：(i) 250mL 一次性搖瓶（康寧），最大工作體積為 54mL；(ii) Ambr 250 模塊化容器（哺乳動物版，兩個 3 葉片段攪拌器，Sartorius），最大工作體積為 250mL；(iii) 50L HyPerforma DynaDrive S.U.B.（賽多利斯），帶有梯形攪拌器組件，該組件帶有三個 2 斜葉片攪拌器和一個 2 葉片掃掠攪拌器，最大工作體積為 50L（圖 1）。

在第一階段，對標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)的補料分批培養(yǎng)（搖瓶）與直接接種 UHCDWCB 的冷凍保存細胞（搖瓶和 Ambr 250）進行了比較。對于這些補料分批實驗，接種細胞密度為 0.2–0.3 × 106 細胞 mL–1。在標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)實驗的初始批次階段 3 天后，以及將冷凍保存的細胞直接轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)系統(tǒng) 4 天后，開始每日補料程序。取樣后，每天以當(dāng)前工作體積 2vol% 的劑量添加補料培養(yǎng)基，總共 12 天。為了將培養(yǎng)系統(tǒng)中的葡萄糖濃度保持在 2gL–1 以上，在需要時添加 450gL–1 葡萄糖溶液。

在第二階段，將強化補料分批培養(yǎng)程序（不進行標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)）轉(zhuǎn)移到 50L 中試規(guī)模。在這里，解凍一個 4.5mL 的 UHCD-WCB 冷凍管，并將細胞轉(zhuǎn)移到起始體積為 5L 的 DynaDrive 生物反應(yīng)器中。根據(jù)細胞的生長情況，在第 2 天到第 6 天之間，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將工作體積線性增加至 38L，以達到補料分批工藝的起始體積。作為實驗室規(guī)模的縮小比較，同時啟動一個 Ambr 容器，接種相同的接種物，每天進行相同的稀釋以模擬體積膨脹，這意味著 Ambr 以 100mL 的最小工作體積啟動，并且在稀釋的第一天必須從生物反應(yīng)器中取出部分細胞懸浮液，以達到與 DynaDrive 相同的稀釋率。從第 7 天開始，在 12 天內(nèi)每天以 2vol% 的工作體積進行推注喂養(yǎng)。

搖瓶在 37℃、8% CO2、80% 相對濕度和 150min-1 搖動速度（搖動幅度 50mm）的搖動培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 Ambr 和 DynaDrive 中的培養(yǎng)采用恒定比功率輸入 40Wm–3、37℃、0.1vvm 覆蓋通氣、pH ≤ 7.2 和溶解氧 (DO) ≥ 40% 進行。pH 和 DO 設(shè)定點通過通入 CO2 或 O2 進行控制。兩個系統(tǒng)均自動添加 1:10 稀釋的消泡劑 C (Sigma-Aldrich) 溶液。DynaDrive 生物反應(yīng)器由 G3Pro 控制器 (Thermo Scientific) 控制。

2.4 灌注模式下的 IgG 生產(chǎn)

灌注模式培養(yǎng)在配備兩個 3 葉段式攪拌器的 3L HyPerforma 玻璃生物反應(yīng)器（Thermo Scientific）中進行。使用 G3Lab 控制器（Thermo Scientific）作為控制單元。培養(yǎng)在 37℃、0.1vvm 覆蓋通氣和 165Wm–3 的恒定比功率輸入下進行。通過噴射器添加 CO2 或 O2 來控制 pH ≤ 7.2 和 DO ≥ 40%。生物反應(yīng)器接種來自一個 4.5mL UHCD-WCB 冷凍管的細胞。灌注模式在培養(yǎng)的第 2 天開始。根據(jù)細胞密度，每天調(diào)整一次灌注率，以保持細胞比灌注率高于 55pLcell–1d–1，直到達到 1.0d–1 的灌注率。在 23 天內(nèi)保持恒定。隨后，將接下來 12 天的灌注率增加到 1.5d–1，將最后 18 天的灌注率增加到 2.0d–1。為了將生物反應(yīng)器的體積保持在 2L 不變，收獲泵由生物反應(yīng)器的重量控制。細胞保留由 suATF2（Repligen）和 XCell Lab 控制器（Repligen）實現(xiàn)。平均流速為 0.9Lmin–1。為了將活細胞體積 (VCV) 保持在不同的設(shè)定點不變，用電容探頭（Incyte Arc、Hamilton Bonaduz）控制排氣泵。為了將葡萄糖濃度保持在 2gL–1，添加了 450gL–1 葡萄糖溶液。為此，使用了 CITSens MeMo 葡萄糖探頭（梅特勒-托利多有限公司，C-CIT 傳感器）。

2.5 分析

每天一次對補料分批和灌注實驗進行取樣，并使用 Cedex HiRes 分析儀（Roche Diagnostics）分析細胞特異性參數(shù) VCD、總細胞密度、活力和細胞直徑。使用 Cedex Bio 分析儀（Roche Diagnostics）測定底物葡萄糖和谷氨酰胺以及代謝物乳酸和銨以及產(chǎn)物 IgG 的濃度。

根據(jù) N-糖基化、電荷變體以及抗體的低分子和高分子種類的比例分析抗體質(zhì)量。使用 Protein A 樹脂純化后，使用親水相互作用超高效液相色譜分析聚糖，使用陽離子交換高效液相色譜分析電荷變體，并使用尺寸排阻色譜分析抗體的低分子和高分子種類

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗室規(guī)模的補料分批實驗

在搖瓶中分別進行了三次補料分批實驗，采用標(biāo)準(zhǔn)接種生產(chǎn)，并直接從搖瓶和 Ambr 生物反應(yīng)器中的冷凍管中接種。強化工藝中的接種細胞密度為 0.20 ± 0.02×106 細胞 mL–1 (SF_int) 和 0.21 ± 0.01 ×106 細胞 mL–1 (AM_int)，而參考搖瓶中的接種細胞密度為 0.28 ± 0.03 × 106 細胞 mL–1 (SF_sta，圖 2a)。正如我們之前的研究 [11,15] 中所見，強化過程中第一天的生長率比參考實驗（SF_sta，0.038 ± 0.005h–1）低 45%，而 AM_int 為 0.017 ± 0.003h–1，SF_int 為 0.017 ± 0.005h–1，指數(shù)期偏移了大約一天。因此，飼料從第 4 天開始，而不是第 3 天。我們之前的實驗和其他團隊已經(jīng)描述了滯后階段和培養(yǎng)開始時活力的輕微下降 [4, 8, 10, 11, 15]。

參考實驗中的最大 VCD 為 18.5 ± 0.9 × 106 細胞 mL–1，在第 6 天達到，在一天后的強化過程中，VCD 為 16.8 ± 1.1 × 106 細胞 mL–1（SF_int）和 13.9 ± 0.4 × 106 細胞 mL–1（AM_int）。在所有實驗中，細胞活力一直保持在 90% 以上，直到培養(yǎng)結(jié)束（圖 2a）。最大 VCD 不同的原因可能是細胞在添加四到五次飼料后進入穩(wěn)定期。如果此時 VCD 較低，則不會進一步增加。因此，較低的最大 VCD 值可以歸因于之前的生長。由于第一次喂食時 VCD 較低（SF_int 為 3.4 ± 0.4 × 106 細胞 mL–1，AM_int 為 3.2 ± 0.3×106 細胞 mL–1，而 SF_sta 為 4.4±0.5 × 106 細胞 mL–1），且 ambr 實驗中的生長率在第 6 天和第 7 天之間保持較低（0.014 ± 0.002h–1，而 SF_int 為 0.019 ± 0.003h–1），因此最大 VCD 保持較低。

盡管如此，IgG 產(chǎn)生的過程是可比的。根據(jù)生長的時間變化，IgG 的產(chǎn)生也偏移了一天（圖 2b）。收獲時，可達到相當(dāng)?shù)淖畲?IgG 滴度 3.71 ± 0.14gL–1 (SF_sta)、3.57 ± 0.07gL–1 (SF_int) 和 3.65 ± 0.03gL–1 (AM_int)。這些滴度與先前研究中描述的滴度相似 [15]。細胞直徑、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的曲線沒有顯示相關(guān)偏差，可在支持信息 (SI；圖 S1) 中找到。結(jié)果表明，UHCD-WCB 可以消除實驗室規(guī)模補料分批工藝對接種物生產(chǎn)的需要。

根據(jù)各種屬性分析了抗體質(zhì)量。N-糖基化中 G0F 聚糖的比例在 82 ± 1% (SF_int 和 AM_int) 和 84 ± 2% (SF_sta) 之間，第二高的比例是 G1F (SI 圖 S4a)。這種糖基化模式很有前景，因為人類 IgG 在體內(nèi)主要以 G0F、G1F 和 G2F 的形式存在 [34]。所有實驗中的電荷變體也相似，主峰約為 40%，酸性和堿性變體各約為 30%（SI 圖 S4b）。碎片和聚集體的比例很低，單體比例在 93 ± 1%（SF_sta）和 94 ± 1%（SF_int 和 AM_int）之間（SI 圖 S4c）。這些結(jié)果表明，使用 UHCD-WCB 對抗體質(zhì)量參數(shù)沒有影響

圖 2. 在搖瓶 (SF) 和 Ambr (AM) 中以標(biāo)準(zhǔn) (sta) 和強化 (int) 接種物生產(chǎn)進行補料分批培養(yǎng)期間，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) IgG 濃度的時間過程。所有實驗的 N = 3。

3.2概念驗證中試規(guī)模補料分批生產(chǎn)

然而，對行業(yè)來說更有趣的當(dāng)然是 UHCD-WCB 在更大規(guī)模上開辟的可能性。由于 DynaDrive 的生物反應(yīng)器概念使得僅使用 5L 的起始體積即可工作，因此 50L 生物反應(yīng)器以 0.18 × 106 細胞 mL–1 開始，僅使用一個 4.5mL 的冷凍管進行接種（見第 2.3 節(jié)）。由于第 2 天和第 6 天之間的連續(xù)稀釋（圖 3b），VCD 在第 4 天之前保持在 1.0 × 106 細胞 mL–1 以下，在第 6 天之前保持在 3.0 × 106 細胞 mL–1 以下，無論是在 DynaDrive 中還是在平行 Ambr 中（圖 3a）。在第一天的滯后期之后直到第 7 天第一次補料，生物反應(yīng)器中的擴增生長呈指數(shù)增長。在第 11 天達到最大 VCD 17.0 × 106 細胞 mL–1（Ambr：14.7×106 細胞 mL–1）之后，DynaDrive 中的細胞存活率在培養(yǎng)結(jié)束時緩慢下降至 85%，而在 Ambr 中，收獲時細胞存活率仍超過 95%（圖 3a）。盡管如此，在整個補料分批階段，DynaDrive 中的 VCD 仍然高于 Ambr。存活率較低很可能是因為在 Ambr 中，一些死細胞被泡沫從懸浮液中漂浮出來并粘附在生物反應(yīng)器壁和其他生物反應(yīng)器元件上，由于工作體積幾乎恒定，它們一直留在那里（圖 3b）。另一方面，在 DynaDrive 中，粘附在生物反應(yīng)器壁上的細胞會隨著反應(yīng)器體積的增加而再次懸浮，因此在取樣過程中也會被檢測到。與其他實驗相比，這兩個生物反應(yīng)器在第 8 天之后的生長減緩是不典型的，并導(dǎo)致最大 VCD 相對較低。

在補料階段（從第 7 天到第 19 天），兩個系統(tǒng)的每日特異性 IgG 生成率 qIgG 相當(dāng)（圖 4b），22.2 ± 5.2 pg 細胞/天（DynaDrive）和 22.0 ± 6.2pg 細胞/天（Ambr），并且達到了相似的 IgG 濃度。經(jīng)過 19 天的實驗，在 DynaDrive 中收獲了 3.58gL-1 IgG，在 Ambr 中收獲了 3.49gL-1（圖 4a），與第 3.1 節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)補料分批的結(jié)果和之前的結(jié)果相當(dāng) [15]。細胞直徑、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的曲線沒有顯示相關(guān)偏差，可以在支持信息中找到（圖 S2）。兩個補料分批工藝結(jié)束時的抗體質(zhì)量在所有屬性上與第 3.1 節(jié)中的實驗相當(dāng)，并且無法確定調(diào)整工藝的影響（SI 圖 S4）。這些結(jié)果表明，綜合起來，UHCD-WCB 和高調(diào)節(jié)比的生物反應(yīng)器可以消除所有小于 50L 的生物反應(yīng)器，從而節(jié)省空間、時間和勞動力。

3.3 概念驗證 2 L 灌注

在補料分批生產(chǎn)實驗中，用 UHCD-WCB 冷凍管中的細胞接種顯示出良好的結(jié)果，然而 mAb 生產(chǎn)的趨勢越來越傾向于灌注。因此，2L 生物反應(yīng)器接種了一個冷凍管中的細胞，并在灌注模式下使用 suATF2 進行操作。在 57 天的培養(yǎng)期內(nèi)測試了四種不同的 VCV 和灌注率設(shè)置，以確定 VCV 特異性抗體生產(chǎn)率和體積生產(chǎn)率最高且細胞活力不會下降太快的 VCV 特異性灌注率范圍（表 1、圖 5a）。

圖 3. 在補料分批培養(yǎng)過程中，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) 生物反應(yīng)器體積的時間過程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的強化 (int) 接種物生產(chǎn)作為縮小參考 (ref)。兩個實驗的 N = 1。

圖 4. 在補料分批培養(yǎng)過程中，a) IgG 濃度和 b) 特定 IgG 生成率 qIgG 的時間過程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的強化 (int) 接種物生產(chǎn)作為縮小參考 (ref)。所有實驗的 N = 1。

在第一階段提供 31 μL mm–3d–1的 VCV 特定灌注率并在最后階段提供 41 μL mm–3d–1 時，細胞存活率高于 97%，但在第二和第三階段，存活率依次下降，分別為 22 和 24 μL mm–3d–1，在第 40 天降至 87%（圖 5b）。

隨著存活率的下降，細胞生長也隨之下降，因此出血率也隨之下降，反之亦然（圖 6）。在兩個高存活率階段，出血率約為 0.50d–1，在第 21 至 27 天之間僅為 0.21 ± 0.07d–1，在第 29 至 38 天之間甚至僅為 0.15 ± 0.06d–1。為了盡可能減少因失血而造成的產(chǎn)品損失，我們的目標(biāo)是盡可能降低細胞生長速度 [38]。但與此同時，細胞存活率也不能下降太多，因為這可能會降低 mAb 質(zhì)量，增加細胞碎片和蛋白質(zhì)的積累，而這些碎片和蛋白質(zhì)在一定程度上會被 ATF 截留。本研究關(guān)于失血率和存活率變化的結(jié)果表明，該細胞系和培養(yǎng)基的最佳 VCV 特異性灌注率為 25 至 30μL/mm–3d–1

表 1. 灌注率、目標(biāo) VCV 和達到的 VCV。

這些結(jié)果也得到了產(chǎn)品形成的支持。在第 21 至 27 天之間的階段，生物反應(yīng)器和收獲物中的 IgG 濃度達到最高（圖 7a）。隨后 VCV 設(shè)定點和灌注率的增加再次導(dǎo)致 IgG 濃度降低，但體積生產(chǎn)率（根據(jù) ATF 下游收獲的 IgG 量相對于生物反應(yīng)器體積計算）從 0.50 ± 0.07gL–1d–1（d21-d27）增加到 0.73 ± 0.05gL-1d-1（d29-d40）（圖 7b）。相比之下，在存活率和生長率較高的階段，只能收獲 0.19 ± 0.04gL–1d-–1（d6-d18）和 0.29 ± 0.07gL–1d–1（d50-d57）。這不僅是因為出血率較高，還因為此階段細胞的 IgG 產(chǎn)物形成率 qIgG 較低（圖 7b）。體積生產(chǎn)率是灌注過程的關(guān)鍵參數(shù)?，F(xiàn)代工藝在 1.0–1.3d–1 的灌注率下可實現(xiàn)約 1gL–1d–1 的生產(chǎn)率[22,23]。然而，這些過程中使用的是 CHO K1 細胞，在如此低的灌注率下，其 VCV 可以生長到 100mm3mL-1 以上，因此，與本研究中的 VCV 特定生產(chǎn)率相當(dāng)，足以實現(xiàn)比本研究中使用的 CHO-S 細胞高得多的生產(chǎn)率。

細胞直徑、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的進程可以在支持信息中找到（圖 S3）。在四個目標(biāo)穩(wěn)態(tài)（第 15 天、第 25 天、第 35 天和第 55 天）中的每一天分析抗體質(zhì)量。盡管與補料分批實驗相比，糖基化模式和批次變體的分布有所不同，但在灌注實驗期間，所有質(zhì)量屬性均保持不變，表明產(chǎn)品質(zhì)量恒定，盡管在過程中設(shè)置了不同的參數(shù)（SI 圖 S5）。

圖 5. 2L 灌注培養(yǎng)期間 a) 灌注率和 VCD，以及 b) 灌注率和活力的時間過程（N = 1）。

圖 6. 2L 灌注培養(yǎng)過程中灌注率和失血率的時間過程（N = 1）。

4 Conclusions 結(jié)論

在之前的研究中，研究了已建立的 UHCD-WCB 在批量模式下的生長和生產(chǎn)行為 [11]，并實現(xiàn)了一步接種生產(chǎn) [15]，本研究的結(jié)果表明，以及如何消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器外的接種生產(chǎn)。在實驗室規(guī)模的補料分批實驗中，直接從 UHCD-WCB 冷凍管接種的工藝與標(biāo)準(zhǔn)工藝僅在一天的滯后階段有所不同。隨后，生長和生產(chǎn)都具有可比性（第 3.1 節(jié)）。

對于工業(yè)生產(chǎn)過程，中試規(guī)模的良好結(jié)果更令人感興趣（第 3.2 節(jié)）。僅用一個凍存管就成功接種了 5L 工作體積的 DynaDrive，一方面表明使用 UHCD-WCB 并直接在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中擴增細胞可以取代 10 天的標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)，僅需額外 4 天的擴增時間，節(jié)省 60% 的時間；另一方面，揭示了立方米規(guī)模的補料分批工藝的兩種可能性：(i) 50L 生物反應(yīng)器可用一個小瓶接種，可在批量或灌注模式下作為 N-1 步驟操作，可用作一次性生產(chǎn)規(guī)模的低種子或高種子補料分批培養(yǎng)的接種物，甚至可以在不銹鋼生物反應(yīng)器中達到兩位數(shù)的立方米規(guī)模；(ii) 通過在 UHCD 范圍內(nèi)的 150mL 冷凍袋中冷凍 WCB，可以成功接種起始體積為 250L 的 5m3 DynaDrive 生物反應(yīng)器。

此外，UHCD-WCB 還用于概念驗證灌注實驗（第 3.3 節(jié)）。所得結(jié)果表明，優(yōu)化工藝可使生產(chǎn)率達到約 0.7gL-1d-1 IgG（基于生物反應(yīng)器體積），持續(xù)數(shù)周或數(shù)月。因此，除去工藝開始時的非生產(chǎn)性生長階段，在灌注模式下，在 15 天內(nèi)可收獲 10.5gL-1 IgG，而補料分批模式下則可收獲約 3.7gL-1 IgG，多出 180%。灌注結(jié)果可轉(zhuǎn)移到中試和生產(chǎn)規(guī)模，類似于補料分批結(jié)果。由于 CHO K1 細胞在灌注過程中比本研究中使用的 CHO-S 細胞具有更高的生產(chǎn)率，因此在 UHCD 范圍內(nèi)冷凍產(chǎn)生 mAb 的 CHO K1 細胞系并使用 DynaDrive 生物反應(yīng)器可以實現(xiàn) 50 L 規(guī)模的高產(chǎn)生產(chǎn)過程，其中不需要外部種子培養(yǎng)

圖 7. a) 生物反應(yīng)器和收獲物中的 IgG 濃度和 IgG 保留率的時間過程，以及 b) 2L 灌注培養(yǎng) (N = 1) 期間生產(chǎn)率和細胞體積特定 IgG 生產(chǎn)率 qIgG。

據(jù)作者所知，這項研究展示了在補料分批和灌注模式下直接接種來自冷凍管的細胞到生產(chǎn)生物反應(yīng)器。由于 DynaDrive 生物反應(yīng)器的調(diào)節(jié)比為 1:10，因此能夠僅用來自一個 4.5 毫升冷凍管的細胞接種 50L 生物反應(yīng)器，并直接在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中進行整個細胞擴增。所示結(jié)果使得在生產(chǎn)工廠中可以只使用生產(chǎn)生物反應(yīng)器，或者如果需要，只使用額外的 N-1 生物反應(yīng)器。可以省略 N-1 之前的任何培養(yǎng)以及幾乎所有的手動處理步驟，從而減少所需的勞動力、時間和空間，并降低污染風(fēng)險。

縮寫詞

CHO      Chinese hamster ovary 中國倉鼠卵巢

DO         Dissolved oxygen 溶解氧

IgG         Immunoglobulin G 免疫球蛋白G

mAb       Monoclonal antibody 單克隆抗體

UHCD    Ultra-high cell density  超高細胞密度

VCD       Viable cell density 活細胞密度

VCV      Viable cell volume 活細胞體積

WCB     Working cell bank 工作細胞庫